Завдяки детальнішому вивченню геномних варіацій, вчені тепер можуть виявляти нові зв’язки з захворюваннями з більшою швидкістю та точністю.
Протягом століть вчені визнавали, що певні хвороби можуть передаватись у спадок, і ця ідея сягає корінням ще Гіппократа. З часом дослідники стали дедалі вправнішими у розкритті того, як ці успадковані закономірності вкорінені в нашому генетичному складі.
Тепер дослідники з EMBL та їхні колеги представили новий потужний інструмент, який вдосконалює технологію одноклітинного дослідження, досліджуючи як геномні варіації, так і РНК в межах однієї клітини. Цей підхід забезпечує більшу точність і масштабованість, ніж попередні методи.
Виявляючи зміни в некодуючих ділянках ДНК – ділянках, де найчастіше виникають варіації, пов’язані з хворобами, – інструмент відкриває нові можливості для дослідження того, як генетичні відмінності впливають на здоров’я. Завдяки своїй здатності детально аналізувати велику кількість окремих клітин, це нововведення знаменує собою важливий крок вперед у зв’язку генетичних варіантів з певними захворюваннями.
«Це була давня проблема, оскільки сучасні методи вивчення ДНК та РНК в одній клітині на окремих клітинах мали обмежену пропускну здатність, бракувало чутливості та були складними», — сказав Домінік Лінденхофер, провідний автор нової статті про SDR-Seq, опублікованої в Nature Methods, та постдокторант Steinmetz Group EMBL. «На рівні окремих клітин можна було зчитувати варіанти в тисячах клітин, але лише за умови їх експресії, тобто лише з кодованих областей. Наш інструмент працює незалежно від того, де розташовані варіанти, даючи кількість варіантів в окремих клітинах, що дозволяє аналізувати складні зразки».
Важлива різниця між кодуючими та некодуючими регіонами
Геном, який складається з ДНК, має як кодуючу, так і некодуючу частини. Гени в кодуючих ділянках порівнювали з інструкціями з експлуатації або рецептами, оскільки ці гени експресуються в РНК, по суті повідомляючи клітині, як виробляти білки – будівельні блоки життя.
Некодувальні ділянки містять багато регуляторних елементів, важливих для розвитку та функціонування клітин. Понад 95% варіантів ДНК, пов’язаних із захворюваннями, знаходяться в цих некодуючих ділянках, проте сучасні інструменти для окремих клітин не забезпечують достатньої пропускної здатності та чутливості для кращого розуміння цих великих ділянок. Досі вчені не могли одночасно спостерігати ДНК та РНК з однієї клітини у великому масштабі, щоб визначити функції варіантів коду ДНК та їх наслідки.
«У цьому некодуючому просторі ми знаємо, що існують варіанти, пов’язані з такими речами, як вроджені вади серця, аутизм та шизофренія, які є значною мірою невивченими, але це, безумовно, не єдині подібні захворювання», – сказав Лінденгофер. «Нам потрібен був інструмент для проведення цього дослідження, щоб зрозуміти, які варіанти функціональні в їхньому ендогенному геномному контексті та як вони сприяють прогресуванню захворювання».
Розшифрування штрих-кодів, що відстежують окремі комірки
Для секвенування ДНК-РНК окремих клітин (SDR-seq) вчені використовували краплі емульсії олії у воді, кожна з яких містила одну клітину, для аналізу як ДНК, так і РНК. Вчені могли фактично вивчати тисячі клітин одночасно в одній пробірці та безпосередньо пов’язувати генетичні зміни з активністю генів. Але такий вид розробки технологій вимагав подолання кількох обмежень і зрештою залучив співробітників з відділів геномної біології та структурної та обчислювальної біології EMBL, медичної школи Стенфордського університету та університетської лікарні Гейдельберга.
Спочатку співробітники дослідницьких груп EMBL Джудіт Заугг та Кьон-Мін Но розробили спосіб «виправлення» клітин для захисту тендітної РНК. Крім того, обчислювальні біологи з дослідницької групи EMBL Олівера Стегла створили спеціалізований інструмент для деконволюції та декодування складної системи штрих-кодування ДНК, необхідної для побудови цієї технології та забезпечення подальшого аналізу даних. І хоча цей декодер був створений спеціально для цього проєкту, вчені очікують, що його можна буде застосувати і в інших дослідженнях.
Дослідники з дослідницьких груп Вольфганга Губера та Саші Дітріх в EMBL та Університетській клініці Гейдельберга відповідно вже проводили скринінг клітин В-клітинної лімфоми для інших дослідницьких проектів. Відповідно, вони надали первинні зразки пацієнтів з великою кількістю геномних варіантів, щоб допомогти протестувати інструмент. Потім Лінденхофер використав ці зразки для спостереження за зв’язками між варіантами та захворюванням. Він виявив, що ракові клітини з більшою кількістю варіантів мали підвищену кількість активованих сигналів, що сприяло росту раку.
«Ми використовуємо ці невеликі реакційні камери для зчитування ДНК та РНК в одній і тій самій клітині», – сказав Лінденхофер. «Це дозволяє нам точно визначити, чи знаходиться варіант на одній чи обох копіях гена, та виміряти його вплив на експресію генів в одних і тих самих клітинах. За допомогою клітин B-клітинної лімфоми ми змогли показати, що залежно від варіантного складу клітин, вони мали різну схильність належати до різних клітинних станів. Ми також змогли побачити, що збільшення кількості варіантів у клітині насправді пов’язане з більш злоякісним станом B-клітинної лімфоми».
Численні можливості інструменту для секвенування окремих клітин
Інструмент SDR-seq тепер пропонує геномним біологам масштаб, точність і швидкість, щоб допомогти краще зрозуміти генетичні варіанти. Хоча зрештою він може відігравати певну роль у лікуванні широкого спектру складних захворювань, спочатку він може допомогти у розробці кращих інструментів скринінгу для діагностики.
«У нас є інструмент, який може пов’язати варіанти з хворобами», — сказав Ларс Штайнмец, старший автор статті, керівник групи EMBL та професор генетики Медичної школи Стенфордського університету. «Ця можливість відкриває широкий спектр біологічних знань, які ми тепер можемо відкрити. Якщо ми зможемо розпізнати, як варіанти насправді регулюють хвороби, і краще зрозуміти цей процес, це означає, що у нас буде краща можливість втрутитися та лікувати їх». Джерело